本发明公开了羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用,其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。实验结果表明,在正常情况下,对照酵母和转基因酵母长势基本一致。但是,在1.4mol/L?NaCl胁迫下,转LcSAP基因酵母的长势明显好于对照(图4B)。说明LcSAP基因明显提高了转基因酵母的耐盐能力。
1.羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.根据权利要求1所述的羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP在培育耐盐胁迫转基因植物品种中的应用。技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及的是羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用。
背景技术
羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)又名碱草,它是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。我国东北部松嫩平原及内蒙古东部为其分布中心,在河北、山西、河南、陕西、宁夏、甘肃、青海、新疆等省(自治区)均有分布。羊草抗寒、抗旱、耐盐碱、耐土壤瘠薄,适应范围广。羊草在漫长的进化过程中积累了丰富的抗逆基因,形成了一套完善的抗逆机制。锌指蛋白是转录因子的一种,与真核生物的生长发育及逆境胁迫的耐受能力都有着重要关系。胁迫相关蛋白(stressassociatedprotein,SAP)是一类含有AN1和A20结构域的锌指蛋白。SAP包含的两个锌指结构AN1和A20都不是植物所特有的。AN1最初在一种动物的类泛素蛋白中发现,在植物中的研究并不多见。在动物中,含A20的锌指蛋白可控制NF-kB的激活和调节,核因子NF-kB是研究得最为广泛的转录因子之一,具有如下特征:对外界信号的刺激反应迅速,控制广泛的基因表达(Vijetal,2006)。水稻中OSISAP1是第一个被克隆出来的AN1/A20型锌指蛋白基因,OSISAP1受到冷、盐、干旱、重金属、伤害、脱落酸诱导表达,转基因烟草证明该基因可以提高植物的对冷害、干旱和高盐的抗逆性(Mukhopadhyayetal,2004)。全基因组分析表明,水稻、拟南芥、番茄中分别有18、14、13个SAP家族成员。水稻和番茄中所有SAP基因家族成员基因都受到一种或多种非生物胁迫诱导表达(Vijetal,2006;Solankeetal,2009)。过表达水稻OsiSAP8基因提高了转基因烟草和水稻的抗寒、抗旱和耐盐能力(Kannegantietal,2008)。过表达水稻SAP基因家族的ZFP177基因提高了转基因烟草耐受低温和氧化胁迫的能力(Huangetal,2008)。过表达獐毛AlSAP基因提高了转基因烟草对干旱、高盐、高温和冰冻的抗性(BenSaadetal,2010)。目前还从苜蓿、甘蔗和毛竹中也克隆得到AN1/A20型锌指蛋白基因(Gimeno-Gillesetal,2011;刘金仙等,2009;刘志伟等,2010)。上述研究表明SAP基因家族基因是一类与非生物胁迫密切相关的基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用。本发明的技术方案如下:羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP,其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。所述的羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP在培育耐盐胁迫转基因植物品种中的应用。实验结果表明,在正常情况下,对照酵母和转基因酵母长势基本一致。但是,在1.4mol/LNaCl胁迫下,转LcSAP基因酵母的长势明显好于对照(图4B)。说明LcSAP基因明显提高了转基因酵母的耐盐能力。
附图说明
图1为LcSAP的核苷酸序列以及编码的氨基酸序列;图2LcSAP和其它植物AN1/A20型锌指蛋白构建的进化树;AlSAP,獐毛(Aeluropuslittoralis),ABK90631;MtSAP,苜蓿(Medicagotruncatula),ABN08135;OsSAP1,水稻(OryzasativaJaponica),BAG97589;PeSAP,毛竹(Phyllostachysedulis),ACL01101;PpSAP,小立碗藓(Physcomitrellapatenssubsp.patens),XP_001771457;PsSAP,美国西加云杉(Piceasitchensis),ADE76549;PtSAP,毛果杨(Populustrichocarpa),XP_002297783;SlSAP5,番茄(Solanumlycopersicum),ACM68442;SoSAP,甘蔗(Saccharumofficinarum),ACT53874;VvSAP,葡萄(Vitisvinifera),XP_002283057;ZmSAP,玉米(Zeamays),NP_001106260。图3LcSAP基因的表达情况;A,LcSAP的组织表达情况:L,叶;R,根。B,LcSAP受胁迫诱导表达情况:Actin基因为内参。图4转LcSAP基因酵母耐盐性鉴定;
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明进行详细说明。一、羊草LcSAP基因的克隆及生物信息学分析1.1材料处理羊草种子在蛭石中萌发,室温光照16小时,温度25°C培养。用1/2MS浇灌至三叶期,每隔三天浇一次。用100mmol/LNa₂CO₃胁迫处理24小时后,取羊草叶片至于液氮中冷冻保存。1.2RNA提取应用TaKaRa公司的RNAiso^TMPlus试剂盒提取羊草叶片总RNA,根据试剂盒说明书步骤进行。用甲醛变性凝胶电泳鉴定总RNA质量,然后在分光光度计上测定RNA含量。1.35’RACE用于5’RACE的cDNA合成采用Clontech公司的SMART^TMRACEcDNAAmplificationKit试剂盒,具体步骤如下:在0.2ml离心管中加入1μgRNA,1μl5’-CDSprimerA,1μlSMARTIIAoligo,然后加入RNase-free水补足5μl,混合离心;72°C水浴2分钟,再冰浴2分钟,瞬时离心;加入提前混合好的5μl混合物,包括2μl5×First-StrandBuffer,1μlDDT(20mmol/L),1μldNTPMix(10mmol/L),1μlM-MLVReverseTranscriptase;轻吸混合物使之均匀,瞬时离心;42°C水浴1.5小时;加入Tricine-EDTABuffer100μl;72°C水浴7分钟,分装后-20°C冰箱中保存备用。根据羊草LcSAP基因EST(CD808976)设计5’RACE特异性引物GSP(5’-TTTGGCTGAGGCAGACGCT-3’)。以cDNA为模板,以GSP和10×UniversalPrimerAMix(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)为引物,50μlPCR反应体系:34.5μlPCR-GradeWater,5μl10×Advantage2PCRBuffer,1μldNTPMix(10mmol/L),1μl50×Advantage2PolymeraseMix,1μlGSP(10μmol/L),5μl10×UniversalPrimerAMix(2μmol/L),2.5μlcDNA。PCR反应条件:94°C2分钟;94°C30秒,55°C40秒,72°C1分钟,35个循环;72°C10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,回收目的片段,与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,选取阳性克隆,由上海生工生物工程有限公司测序。1.4RT-PCR克隆羊草LcSAP全长基因用于RT-PCR的cDNA合成采用Promage公司的ReverseTranscriptionSystem反转录试剂盒,具体步骤:将1μgRNA于70°C孵育10分钟,瞬时离心,置于冰上;4μlMgCl₂(25mmol/L),2μlReverseTranscription10×Buffer,2μldNTPMixture(10mmol/L),0.5μlRibonucleaseinhibitor,15UAMVReverseTranscriptase,0.5μgOligo(dT)₁₅Primer,加入去离子水至20μl。根据5’RACE的测序结果与EST(CD808976)序列拼接后得到的序列设计引物F1(5’-CCACCCAAAAGGAAAGGAC-3’)和R1(5’-GAAGTAAACCTGACGGACCAAG-3’)。以cDNA为模板,以F1和R1为引物,50μlPCR反应体系:1μlcDNA,1μlF1(10μmol/L),1μlR1(10μmol/L),25μlPremixTaq^TM,22μl去离子水。PCR反应条件:94°C2分钟;94°C30秒,55°C40秒,72°C1分钟,35个循环;72°C10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,回收目的片段,与pMD18-T载体连接,构建重组载体pMD18-T-LcSAP,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,选取阳性克隆,由上海生工生物工程有限公司测序。1.5生物信息学分析通过ORFfinder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析LcSAP基因开放阅读框。LcSAP基因全长889bp,包括211bp的5’非编码区和192bp的3’非编码区,开放阅读框为486bp,编码161个氨基酸残基(图1)。利用NCBI的CDD(ConservedDomainDatabase)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析LcSAP的保守结构域,结果表明在LcSAP的N末端具有四个保守的半光氨酸残基,这种结构与抑制细胞凋亡的锌指蛋白A20类似;在蛋白的C端具有AN1类型的典型锌指结构域:Cx2-4Cx9-12Cx2Cx4Cx2Hx5HxC(x代表任意的氨基酸),其中保守的半胱氨酸和组氨酸残基可以参与形成锌指结构。利用Mega4.1将羊草LcSAP与其他物种的SAP基因的氨基酸序列进行聚类分析,构建LcSAP的进化树。从进化树可以看出,羊草LcSAP与獐毛AlSAP同源性最高,同源性为57.1%;与苜蓿、水稻、毛竹、小立碗藓、美国西加云杉、毛果杨、番茄、甘蔗、葡萄、玉米序列同源性为40.8%-45.1%(图2)。二、半定量RT-PCR分析羊草LcSAP基因的组织表达模式将羊草培养至三叶期,取羊草叶和根至于液氮中冷冻保存。应用TaKaRa公司的RNAiso^TMPlus试剂盒提取羊草叶和根总RNA。应用Promage公司的ReverseTranscriptionSystem反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。根据羊草Actin基因序列(AB181991)设计引物F2(5’-GGACCTTGCTGGTCGTGACC-3’)和R2(5’-CCTCAGGGCACCTGAACCTTT-3’)。以羊草叶和根cDNA为模板,以F1和R1(或F2和R2)为引物,50μlPCR反应体系:1μlcDNA,1μlF1(或F2)(10μmol/L),1μlR1(或R2)(10μmol/L),25μlPremixTaq^TM,22μl去离子水。PCR反应条件:94°C2分钟;94°C30秒,55°C30秒,72°C1分钟,30个循环;72°C10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。半定量RT-PCR结果表明羊草LcSAP基因在羊草的叶和根中均有表达,在叶中表达量相对较高(图3A)。三、半定量RT-PCR分析羊草LcSAP基因的胁迫诱导表达模式将羊草培养至三叶期,用400mmol/LNaCl,100mmol/LNa₂CO₃和20%PEG6000处理三叶期羊草,胁迫处理后0小时、6小时、12小时、24小时后,提取羊草叶片RNA。应用Promage公司的ReverseTranscriptionSystem反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。以羊草cDNA为模板,以F1和R1(或F2和R2)为引物,50μlPCR反应体系:1μlcDNA,1μlF1(或F2)(10μmol/L),1μlR1(或R2)(10μmol/L),25μlPremixTaq^TM,22μl去离子水。PCR反应条件:94°C2分钟;94°C30秒,55°C30秒,72°C1分钟,30个循环;72°C10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。半定量RT-PCR结果表明LcSAP受到400mMNaCl、100mMNa₂CO₃、20%PEG6000的胁迫诱导表达,但是表达形式有所不同。在NaCl胁迫下LcSAPmRNA表达量逐渐升高;在Na₂CO₃胁迫下LcSAPmRNA表达量先升高再降低,在胁迫后6小时的表达量最高;在PEG6000胁迫下LcSAPmRNA表达量先降低再升高,在胁迫后12小时的表达量最低,在24小时的表达量最高。说明LcSAP受到中性盐、碱性盐和干旱的胁迫诱导表达(图3B)。四、转基因酵母验证LcSAP基因功能4.1pYES2/CT-LcSAP载体构建根据LcSAP基因序列设计引物F3(5’-AATTAAGCTTATGGCGCAAGAGAGTTGGA-3’)和R3(5’-GACTGAATTCTCAGAATCTGGTGACCTTATCAG-3’)。以pMD18-T-LcSAP为模板,以F3和R3为引物,50μlPCR反应体系:1μlcDNA,1μlF1(10μmol/L),1μlR1(10μmol/L),25μlPremixTaq^TM,22μl去离子水。PCR反应条件:94°C2分钟;94°C30秒,55°C30秒,72°C1分钟,30个循环;72°C10分钟。用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,回收目的片段。提取pYES2/CT质粒。将LcSAP基因PCR产物和pYES2/CT质粒分别用HindIII和EcoRI限制性内切酶进行双酶切。酶切反应体系如下:1μlHindIII,1μlEcoRI,2μl10×MBuffer,5μlPCR产物(或pYES2/CT质粒),11μl去离子水。37°C1小时,电泳用后回收目的基因和线性化载体。将回收的目的基因和线性化载体在T4DNA连接酶的作用下16°C连接1小时。连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞,挑取单克隆菌落提取质粒,HindIII和EcoRI双酶切鉴定,阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。鉴定为阳性的重组载体命名为pYES2/CT-LcSAP。4.2转化酿酒酵母菌株INVSc1酿酒酵母转化采用LiAc方法,具体步骤:挑取酿酒酵母菌株INVSc1单克隆放入10mlYPD液体培养基中,30°C培养过夜;菌液稀释成50mlOD600=0.4,在培养3小时;1500g离心收集细胞,用40ml1×TE重悬沉淀;1500g离心收集细胞,用2ml1×LiAc/0.5×TE重悬沉淀;室温放置10分钟;混合1μgpYES2/CT-LcSAP质粒(或pYES2/CT质粒),100μg变性的硅精DNA,100μl酵母菌悬液和700μl1×LiAc/40%PEG3350/1×TE,充分混合,30°C培养30分钟;加入88μlDMSO混均,42°C热激7分钟,离心10秒钟去除上清;用1ml1×TE重悬沉淀,再次离心收集细胞;用100μl1×TE重选沉淀,涂布在含有Amp抗性的YPD平板上,筛选转化子。4.3Northern杂交提取含有pYES2/CT和pYES2/CT-LcSAP的酿酒酵母RNA,步骤如下:用1ml预冷AE缓冲液(50mmol/L乙酸钠,pH5.2;10mmol/LEDTA,pH8.2)重悬离收集的酵母细胞,16000g,4°C,离心10秒钟;弃上清,重复以上步骤;用400μl预冷的AE缓冲溶液重悬酵母细胞,加入40μl10%SDS充分混均,再加入440μl预先用AE缓冲液平衡的苯酚溶液(pH5.2)充分混均;用液氮快速冷冻细胞5分钟,转移细胞至65°C水浴5分钟;重复用AE,10%SDS和苯酚溶液混均,再用液氮快速冷冻细胞5分钟,16000g,室温离心7分钟;转移上清至另一个新的1.5mlEP管里,加入600μl酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)震荡;16000g,4°C,离心5分钟,转移上清至另一个新的1.5mlEP管里;加入50μl3mol/L乙酸钠(pH5.2)和1ml预冷的无水乙醇,-20°C放置20分钟;16000g,4°C,离心15分钟,弃上清,加入1ml预冷的80%乙醇;16000g,4°C,离心15分钟,弃上清,干燥沉淀,用100μlRNase-free水溶解沉淀。Northern杂交采用Roche公司的DIG-HighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI试剂盒。探针制备步骤如下:LcSAP基因全长PCR产物作为探针,取16μl探针沸水浴10分钟变性,立即放入冰水混合物中,加入4μlDIG-HighPrime到变性后的模版中,混匀后离心,37°C孵育20小时。Northern杂交步骤如下:RNA样品在1.2%甲醛变性胶中50V下电泳3小时,将RNA转移到Hybong-N+尼龙膜上,用2×SSC溶液洗膜5分钟。50°C预杂交30分钟。探针于100°C煮沸10分钟,迅速放于冰中。含有探针的杂交液50°C杂交过夜。洗液I室温洗2×10分钟。洗液II68°C洗2×15分钟。Washingbuffer室温洗膜5分钟。40mlBlockingbuffer室温洗膜30分钟。20mlAntibodySolution室温洗膜30分。50mlWashingbuffer室温洗膜2×15分钟。20mlDetectingbuffer室温洗膜5分钟。加入10ml显色液(10mlDetectingbuffer和200μlNBT/BCIP),黑暗放置1小时。通过Northern杂交表明LcSAP基因在转基因酿酒酵母中得到了表达(图4A)。4.4转LcSAP基因酵母的诱导培养及耐盐性实验转LcSAP基因酵母诱导培养具体步骤如下:挑取对照酵母(转pYES2/CT空载体的酵母)和转基因酵母(转pYES2/CT-LcSAP重组载体的酵母)单菌落,接种与SC-U液体培养基中(加入终浓度为2%的葡萄糖)中,30°C振荡培养24小时;调整5ml的培养液OD600为0.3;6000rpm离心1分钟;用1ml诱导培养基(SC-U含有2%半乳糖和2%面子糖)重悬菌体,接种于50ml的诱导培养基中30°C振荡培养24小时。转LcSAP基因酵母耐盐性实验具体步骤如下:从对照酵母和转基因酵母中各取1μl,按照10^-1、10^-2、10^-3倍数进行稀释;从各稀释的酵母液中去5μl在YPD培养基和含有1.4mol/LNaCl的YPD培养基上点板;30°C培养72小时,拍照记录。结果表明,在正常情况下,对照酵母和转基因酵母长势基本一致。但是,在1.4mol/LNaCl胁迫下,转LcSAP基因酵母的长势明显好于对照(图4B)。说明LcSAP基因明显提高了转基因酵母的耐盐能力。应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。序列表SEQUENCELISTING<110>申请人西北农林科技大学<120>羊草胁迫相关蛋白基因LcSAP及其应用<130><160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>889<212>DNA<213>LcSAP的核苷酸序列<400>1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>2<211>161<212>PRT<213>LcSAP编码的氨基酸序列<400>2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="519"/><210>3<211>19<212>DNA<213>GSP<400>3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>4<211>22<212>DNA<213>10×UniversalPrimerAMix<400>4ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>5<211>19<212>DNA<213>F1<400>5ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>6<211>22<212>DNA<213>R1<400>6ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>7<211>20<212>DNA<213>F2<400>7ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>8<211>21<212>DNA<213>R2<400>8ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/><210>9<211>29<212>DNA<213>F3<400>9ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" 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